La grippe porcine est une infection virale hautement contagieuse des porcs. Les infections à virus influenza porcin (SIV, Swine influenza virus) sont la cause d’une maladie respiratoire caractérisée par de la toux, des éternuements, du jetage, des températures rectales élevées, de la léthargie, une respiration difficile et une baisse de l’appétit. Dans certains cas, les infections à SIV sont associées à des troubles de la reproduction tel l’avortement. Les signes cliniques et l’excrétion nasale du virus peuvent survenir dans les 24 h suivant l’infection. Les taux de morbidité peuvent atteindre 100 % dans les cas d’infections par le SIV, tandis que les taux de mortalité sont généralement faibles. Les infections bactériennes secondaires peuvent aggraver les signes cliniques résultant de l’infection à SIV. La transmission se fait par contact avec des sécrétions contenant des particules virales, telles que les aérosols, générés par les toux et les éternuements, et les jetages nasaux ().

Un peu plus en détail, le virus influenza porcin (SIV) est un orthomyxovirus de type A, à génome à ARN segmenté. Les virus influenza porcins de type A sont eux-mêmes subdivisés sur la base de leurs Protéines : hémagglutinine et neuraminidase. Les sous-types de SIV qui sont les plus fréquemment identifiés chez les porcs sont H1N1, H1N2 et H3N2. Les autres sous-types qui ont été identifiés chez les porcs incluent H1N7, H3N1, H4N6 et H9N2. Les virus H1N1, H1N2 et H3N2 trouvés en Europe sont antigéniquement et génétiquement différents de ceux trouvés aux États-Unis d’Amérique (). Les porcs ont, dans leur tractus respiratoire, des récepteurs qui vont lier les virus influenza porcins, humains et aviaires. En conséquence, les porcs ont été appelés « récipients de mélange » pour l’apparition de nouveaux virus influenza lorsque des virus influenza porcins, humains et aviaires subissent des recombinaisons chez les porcs ().

I. L’EPIDEMIE

Des cas de grippe porcine chez l’humain ont été signalés au Mexique, au Canada, aux États-Unis, en Écosse et en Espagne. D’autres pays ont signalé des cas suspects.
Le virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) est causé par une souche du virus de la grippe qui affecte habituellement les porcs, mais qui peut également s’attaquer aux humains.
Le virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) est une maladie respiratoire qui entraîne des symptômes semblables à ceux de la grippe saisonnière humaine. Ces symptômes sont la fièvre, la fatigue, le manque d’appétit, la toux et les maux de gorge. Certains patients affectés de grippe porcine ont également rapporté des vomissements et de la diarrhée.
Plusieurs souches de grippe se propagent continuellement dans notre environnement, y compris des souches qui peuvent rendre malades les êtres humains, les oiseaux et les porcs.

Il arrive que des souches de grippe se transmettent des humains aux animaux, et réciproquement, à la suite d'un contact direct, comme dans les élevages de porcs ou les foires de bétail. Dans le cas des personnes qui sont en contact avec des porcs, les recommandations visant à éviter l’infection sont identiques à celles qui s'appliquent à la grippe saisonnière – lavage fréquent des mains, vaccin antigrippal annuel, se couvrir la bouche en cas de toux ou d'éternuement et rester au lit quand on se sent malade.

Lorsqu'un virus du virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) atteint un être humain, il y a des risques que la grippe animale subisse une mutation et se propage ensuite directement d’une personne à l’autre.  
Ce virus est contagieux car plusieurs personnes affectées au Mexique et aux États-Unis n'ont pas été en contact direct avec des porcs, nous savons que le virus s'est propagé d'une personne à l’autre.
Des recherches plus approfondies sont nécessaires à propos de la transmission du virus entre êtres humains, mais nous croyons qu'il se propage de la même manière que la grippe saisonnière.

La grippe et d'autres infections respiratoires se transmettent d'une personne à l’autre par la pénétration des germes par le nez ou la gorge. La toux et les éternuements expulsent les germes en l'aire d'où ils peuvent être aspirés par d'autres personnes. Les germes peuvent aussi se déposer sur des surfaces rigides comme les surfaces de travail et les poignées de porte, d'où ils se transmettent aux mains et ensuite au système respiratoire lorsque la personne se touche la bouche ou le nez.

La souche humaine du virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) signalée au Mexique, au Canada et aux États-Unis constitue un nouveau virus de la grippe.
Puisqu'il s'agit d'une nouvelle souche, il est probable que les gens n'ont pas d'immunité naturelle contre le virus. Les experts internationaux craignent que cette souche puisse se propager rapidement. Une enquête est en cours sur le mode de propagation du virus. Des administrations publiques du monde entier, ainsi que l'Organisation mondiale de la Santé, sont engagées dans des recherches sur ce problème pour être en mesure de trouver une solution.

Les cas humains de grippe porcine ne sont pas  tous graves.  Les cas humains du virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) signalés au Canada et aux États-Unis jusqu’à maintenant étaient moins graves que ceux qui ont été constatés au Mexique. Les cas signalés au Mexique ont été plus graves, touchant surtout des jeunes en bonne santé dont l'état a rapidement détérioré d'une manifestation bénigne de la maladie à une détresse respiratoire grave, pendant une moyenne de cinq jours.

Faut-il éviter d’entrer en contact avec des porcs ?

Dans le cas présent, nous savons que le virus du virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) se transmet entre êtres humains et non pas directement des porcs aux humains. Par conséquent, être à proximité de porcs ne pose pas de risques.
Toutefois, étant donné que les humains peuvent également transmettre la maladie aux porcs, les personnes qui éprouvent les symptômes de la grippe doivent éviter d'entrer en contact avec des porcs afin de réduire la possibilité de transmission de la maladie au sein de la population des porcs domestiques.
Des agences  procèdent à des études pour acquérir plus de connaissances sur la manière dont se transmet cette souche particulière de grippe porcine chez l’être humain.

On ne Peut pas attraper cette maladie en mangeant du porc. Le virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) ne se transmet pas par la viande de porc. Continuez simplement à suivre des procédures adéquates de manipulation et de cuisson de la viande pour diminuer les risques d’attraper une intoxication alimentaire.

L’OMS a déclaré l’activation de la phase pandémique.  En quoi consistent ces phases ? Comment passe-t-on d’une phase à l’autre ?

En bref, l’OMS reconnaît actuellement six stades de préparation et d’intervention dans la lutte contre les pandémies de grippe. 

• Phase 1 : Les virus de la grippe sont transmis parmi les animaux, particulièrement les oiseaux. L’on n’a pas constaté de transmission d’un virus par des animaux à des êtres humains.
• Phase 2 : L’on a constaté l’infection d’un être humain par un virus grippal circulant chez des animaux. Risque de pandémie.
• Phase 3 : L’on constate un nombre limité de cas de maladie attribuable à un virus grippal circulant parmi des animaux ou transmis par des animaux à des êtres humains. La transmission d’une personne à une autre se produit parfois – mais elle n’est pas généralisée.
• Phase 4 : L’on confirme la transmission d’une personne à l’autre d’un virus circulant parmi des animaux ou transmis par un animal à un être humain, qui provoque des foyers d’éclosions plus élargis ou la propagation au sein de la communauté. Le risque de pandémie est plus élevé, mais ce fléau n’est pas inévitable.
• Phase 5 : L’on confirme la transmission du virus d’une personne à l’autre dans au moins deux pays d’une région de l’OMS. Une pandémie est probablement imminente. Il ne reste pas beaucoup de temps pour terminer l’organisation, la mise en place de protocoles de communication et le lancement des stratégies d’atténuation planifiées.
• Phase 6 : La phase de pandémie. Des éclosions communautaires sont confirmées dans au moins un pays situé dans une autre région de l’OMS – ce qui indique qu’une pandémie mondiale est en cours.

Le directeur général de l’Organisation mondiale de la Santé est chargé de décider à quel moment augmenter le niveau pandémique, sur le fondement des rapports que lui présentent les pays où sévit la maladie.
Dans cette affaire, l’objectif principal des autorités à tous les niveaux et de ralentir la propagation de ce virus A H1N1.
Des mesures s’imposent à l’heure actuelle pour atteindre cet objectif :

• Emission des avis et des avertissements à l’intention des voyageurs souhaitant partir dans des pays affectés.  
• Postage des agents de quarantaine (agents sanitaires) dans tous les aéroports accueillant des vols en provenance du Mexique, afin d’examiner tous les voyageurs malades.
• Formation des agents frontaliers pour apprendre à reconnaître les voyageurs malades, filtrage de tous les passagers qui descendent des vols directs en provenance de certains pays fortement affectés.
• Bulletins d’information sur la manière de se protéger, outre les avertissements médicaux qui leur sont présentés à bord de l’avion à l’intention de tous les voyageurs vers le Mexique.
• Affichage des bulletins d’alerte sur des écrans télévisés se trouvant devant les portes d’embarquement des aéroports.
• Rapport de tous les cas positifs et formation sur la gestion des cas confirmés ou suspects.
• Demander aux différents laboratoires d’envoyer tous les virus non identifiés, ainsi que tous les échantillons prélevés auprès de patients affectés de maladies respiratoires sévères, aux Laboratoires nationaux de référence
• Traitement et Mesures prophylactiques : Emploie des médicaments antiviraux pour traiter les maladies actives graves et pour prévenir l’infection des personnes susceptibles qui font partie de l’entourage des patients affectés –

Parmi les mesures de protection personnelle retenons :

• Se laver les mains soigneusement avec du savon et de l'eau chaude, ou utiliser un désinfectant pour les mains;
• Se couvrir la bouche avec le bras ou la manche en cas de toux ou d'éternuement;
• Se faire administrer le vaccin annuel contre la grippe;
• Poursuivre ses activités habituelles, mais rester à la maison lorsque l’on se sent malade;
• Consulter un professionnel de la santé en cas de symptômes graves semblables à ceux de la grippe.

Pour le traitement étiologique, des recherches antérieures indiquent qu’il y a deux médicaments antiviraux sur ordonnance, l’oseltamivir (Tamiflu) et le zanamivir (Relenza), qui traitent efficacement le virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain). Mais, on ne recommande l’emploi de médicaments antiviraux pour traiter le virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) que lorsque la gravité de la maladie est modérée à sévère et que le patient court des risques élevés de souffrir des complications.

Mais certaines agences comme L’ASPC au Canada ne recommandent pas, pour le moment, l’administration de médicaments antiviraux lorsque la maladie est bénigne ou comme mesure de prévention.

Voici les raisons de cette décision :

• Nous ne disposons pas de suffisamment d’information pour déterminer si le virus grippal requiert l’utilisation d’antiviraux. La plupart des patients au Canada et aux États-Unis se rétablissent adéquatement sans médicaments.
• Il existe un risque que le virus devienne résistant au traitement antiviral si ces médicaments sont utilisés de manière excessive pour traiter les manifestations bénignes de la maladie.
• La réserve de médicaments antiviraux est une ressource limitée. Nous devons nous assurer de ne pas en manquer avant d’en avoir vraiment besoin.

Par ailleurs, les antiviraux sont des médicaments employés pour la prévention et le traitement précoce de la grippe. Si on en prend peu de temps après le début de la maladie (dans les 48 heures), ils peuvent atténuer les symptômes de la grippe, raccourcir la durée de la maladie et probablement prévenir les complications graves en découlant.

Les antiviraux réduisent la capacité de reproduction du virus, mais n'immunisent pas contre le virus. Deux antiviraux différents sont utilisés dans le traitement du virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) H1N1 chez l'humain, l'oseltamivir (Tamiflu) et le zanamivir (Relenza).

Pour le vaccin : disons qu’un vaccin est une formule qui provoque l’immunisation du patient contre une maladie en stimulant la production d’anticorps. Les vaccins sont le principal outil de prévention de la maladie et de la mort causées par la grippe. Ils stimulent la production d'anticorps dirigés contre les éléments du virus de la grippe contenus dans le vaccin, provoquant ainsi l’immunisation du patient contre le virus.
Afin d'assurer une protection efficace, chaque vaccin doit être mis au point pour lutter contre une souche de grippe précise. Le vaccin n’est pas encore disponible.
Certains pays sont  dotés d'un plan de préparation de vaccins en cas de pandémie. Une fois le virus identifié, le développement et les essais pour formuler un vaccin efficace nécessiteront une période d'environ six mois.

L'immunisation de l'année courante contre la grippe dans certains pays, ou le vaccin antigrippal, offre une protection contre la souche humaine de la grippe H1N1. La souche H1N1 du virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) est différente de la souche de la grippe humaine. Il est peu probable que le vaccin contre la grippe saisonnière offre une protection contre le virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain). Le vaccin antigrippal assure une protection contre la grippe saisonnière, qui sévit toujours au Mexique.

Les décisions concernant la fermeture des écoles sont prises par certaines autorités. Cela peut être adéquat dans certaines circonstances. On recommande aux personnes malades de rester à la maison pour réduire les risques de propagation. Si ce virus de la grippe se propage, il est préférable que les citoyens évitent les foules pour diminuer les possibilités de contagion.

Les citoyens doivent continuer de prendre les mesures de protection normales qu’ils emploient pour se protéger de la grippe ordinaire. Pendant que l’enquête sur la transmission de ce virus continue, le meilleur conseil est de se laver les mains fréquemment, de se couvrir la bouche lorsqu’on tousse ou éternue et  rester à la maison lorsqu’on se sent malade.

L’Agence de la santé publique du Canada ne recommande pas aux citoyens de porter des masques chirurgicaux pour se protéger du virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain). Il a été démontré que cette mesure n’est pas efficace pour éviter la transmission de la grippe au sein de la population. Les gens portent souvent leur masque de manière inadéquate, ou ils le contaminent lorsqu’ils le mettent en place ou l’enlèvent, ce qui augmente, en fait, les risques de contagion. ()
La seule exception concerne les personnes atteintes par le virus H1N1 (grippe porcine chez l’être humain) et les personnes qui éprouvent des symptômes semblables à ceux de la grippe. Pour la protection des personnes qui se trouvent à leur proximité, comme les médecins, les infirmières et les préposés de soins à domicile, les personnes atteintes pourraient être tenues de porter un masque. ()

Les professionnels de la santé doivent se laver les mains fréquemment. Lorsqu’ils se trouvent à proximité de patients atteints, ils doivent employer des mesures de précaution supplémentaires, comme porter des masques et des lunettes de protection.

Comment diagnostiquer au laboratoire le SIV ?

II. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène

Parce que le SIV est un agent potentiellement pathogène pour l’homme, tous les travaux impliquant la manipulation de tissus infectés, d’écouvillons, d’œufs embryonnés et de cultures cellulaires doivent être menés en laboratoire de biosécurité de classe II.

• Culture

Traitement de l’échantillon

Le tissu pulmonaire peut être traité de différentes manières en vue de l’isolement viral, avec par exemple mortier et piston, broyeur, homogénéisateur, ou émincé à l’aide d’une lame de scalpel ou de ciseaux. Le traitement du tissu se fait dans du milieu de culture cellulaire supplémenté en antibiotiques (i.e. 10× concentration de travail), à une concentration finale de 10 % poids/volume. La suspension peut être incubée pendant 30 min à l’obscurité à 20-22°C. Les écouvillons nasaux doivent être collectés dans du milieu de culture cellulaire ou dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS). A réception au laboratoire, les écouvillons nasaux sont agités vigoureusement à la main ou sur un agitateur vortex. Les suspensions issues des écouvillons et des poumons sont centrifugées à 1 500-1 900 g pendant 15 à 30 min à 4°C. Le surnageant est collecté et conservé à 4°C jusqu’à l’inoculation. Si le surnageant ne peut être inoculé dans les 24 h suivant la collecte, il doit être stocké à –70°C. Le surnageant d’un broyat de poumon est inoculé sans dilution supplémentaire. Le surnageant issu d’un écouvillon nasal peut également être inoculé sans dilution, ou dilué au 1/3 dans du milieu de culture cellulaire. Les antibiotiques sont ajoutés au milieu de culture cellulaire utilisé pour le traitement, et/ou le surnageant peut être filtré, afin de réduire les risques de contamination bactérienne, mais ceci peut diminuer le titre viral.

• Isolement viral en culture cellulaire

I) L’isolement viral peut être conduit sur des lignées cellulaires permissives à l’infection SIV. La lignée de rein de chien de Madin-Darby (MDCK pour Madin-Darby Canine Kidney) est la lignée cellulaire de choix, mais des cellules primaires de rein de porc, de testicules de porc, ou des lignées de cellules épithéliales de poumon de porc peuvent être utilisées ;

II) Laver 3 fois les monocouches de cellules confluentes (48 à 72 h après l’ensemencement) avec du milieu de culture cellulaire contenant une concentration finale de 2 µg/ml de trypsine ; la concentration dépendra du type de trypsine et pourra atteindre 10 µg/ml. Le milieu de culture cellulaire peut être supplémenté en antibiotiques, mais n’est pas supplémenté en sérum fœtal de bovin ;

III) Inoculer les cultures cellulaires avec une quantité appropriée de suspension de tissu ou de surnageant d’écouvillon. Remarque : le volume de l’inoculum variera en fonction de la taille du récipient de culture cellulaire. En général, 100 à 200 µl sont inoculés dans chacun des puits d’une plaque de culture de 24 puits, 1 ml dans un tube Leighton, et 1 à 2 ml dans un flacon de 25 cm

IV) Incuber les cultures cellulaires inoculées pendant 1 à 2 h à 37°C. Quand les récipients de culture cellulaire sont ouverts à l’environnement, comme les plaques de culture, l’incubation doit être faite dans un incubateur humidifié, en présence de 5 % de CO.

V) Eliminer l’inoculum et laver la monocouche de cellules 3 fois avec le milieu de culture cellulaire contenant la trypsine ;

VI) Ajouter un volume approprié de milieu de culture cellulaire de survie dans tous les récipients et incuber à 37°C pendant 7 jours, tout en observant régulièrement afin de noter l’apparition d’un effet cytopathogène (ECP). Si aucun ECP n’est observé à la fin de la période d’incubation, le récipient de culture cellulaire peut être congelé à –70°C, décongelé, et un deuxième passage en aveugle peut être réalisé comme décrit ci-dessus [étape III)]. Si un ECP est observé, un aliquot du milieu de culture cellulaire peut être testé quant à la présence d’un virus hémagglutinant, et peut être collecté et utilisé comme inoculum pour confirmation par la technique d’immunofluorescence (voir Section B.1.e. ci-dessous). Des monocouches de cellules MDCK (ou autre lignée cellulaire appropriée), sur lamelles (tube Leighton, plaques de culture 24 puits) ou dans des chambres de culture sur lame, peuvent être inoculées à ce propos. La méthode d’isolement est la même que décrite plus haut [étape III)]. Dans certains cas, il peut être nécessaire de faire des dilutions de 10 en 10 du virus multiplié en culture cellulaire afin d’avoir un ECP approprié sur la lame. Les sous-types de SIV peuvent être déterminés par les tests d’inhibition de l’hémagglutination (IH) et de la neuraminidase (IN).

Inoculation d’œufs (14)

I) Utiliser des œufs de poule embryonnés de 10 à 11 jours d’âge ;

II) Inoculer 0,1 à 0,3 ml d’inoculum dans la cavité allantoïdienne et le sac amniotique. Beaucoup de laboratoires inoculent uniquement par voie allantoïdienne avec une sensibilité similaire. Généralement, 4 œufs sont inoculés par échantillon ;

III) Incuber les œufs à 35-37°C pendant 3 à 4 jours et mirer quotidiennement. Les œufs dont les embryons meurent dans les 24 h suivant l’inoculation sont éliminés ;

IV) Réfrigérer les œufs dont les embryons sont morts plus de 24 h après l’inoculation. A la fin de la période d’incubation, prélever les liquides allantoïdiens et amniotique des œufs portant des embryons morts et des œufs avec des embryons encore viables. Tous les produits des œufs doivent être considérés comme potentiellement infectieux et doivent être traités de manière à prévenir l’exposition du manipulateur au SIV ;

V) Centrifuger les liquides à 1 500-1 900 gpendant 10 à 20 min à 4°C. Transférer le surnageant dans un autre tube pour analyse ;

VI) Les fluides sont analysés vis-à-vis de la présence de SIV à l’aide d’un test d’hémagglutination (HA) (voir ci-dessous) ;

VII) Réinoculer les fluides ne présentant pas d’activité hémagglutinante (négatifs pour le SIV) sur œufs ou sur cultures cellulaires, comme décrit ci-dessus. L’isolement peut être amélioré en diluant les liquides de 10 en 10 dans du milieu de culture cellulaire. Des antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu de culture cellulaire.

• Test d’hémagglutination

I) Préparer une suspension d’érythrocytes à 0,5 % à partir de sang de dindon ou de poulet. Le sang de dindon est utilisé dans quelques laboratoires des États-Unis d’Amérique, mais il n’est pas recommandé pour l’identification des isolats européens. Les érythrocytes lavés et les suspensions d’érythrocytes à 0,5 % peuvent être conservés à 4°C pendant 1 semaine. Eliminer en cas d’hémolyse ;

II) Déposer 50 µl de PBS dans une rangée de 12 puits d’une plaque de microtitrage à 96 puits à fonds en V- ou en U-, ceci pour chaque virus à identifier. Une rangée supplémentaire de puits doit être incluse pour un témoin positif ;

III) Ajouter 50 µl d’isolat non dilué dans le premier puits de chaque rangée correspondante ;

IV) Diluer l’isolat en série à l’aide d’une micropipette réglée pour délivrer 50 µl. Les dilutions résultantes vont ainsi aller de 1/2 (puits n°1) à 1/2048 (puits n°11). Le puits n°12 contient seulement du PBS et sert de témoin cellulaire ;

V) Ajouter 50 µl de suspension d’érythrocytes à 0,5 % dans chaque puits et agiter la plaque pour bien mélanger. Remarque : bien maintenir les érythrocytes en suspension pendant l’étape de distribution ;

VI) Couvrir la plaque avec du film adhésif et incuber à température ambiante jusqu’à ce qu’un culot distinct se soit formé dans le puits témoin (30 à 60 min) ;

VII) Dans les puits où l’hémagglutination est complète (HA positive, SIV présent), les érythrocytes se dispersent dans tout le puits en formant un tapis continu d’apparence mate au fond de la cupule. Les puits où les érythrocytes sédimentent au fond de la cupule en formant un culot central sont négatifs au regard de l’activité hémagglutinante (négatif pour le SIV). Une activité HA incomplète est mise en évidence par la formation de culots partiels, caractérisés par des bords flous ou ressemblants à des beignets. Quand l’interprétation entre inhibition complète et incomplète est difficile, incliner la plaque de microtitration d’environ 45 degrés pendant 20 à 30 secondes et observer le coulage, lequel produit, dans les puits où l’inhibition est complète, une traînée de cellules, fine, légèrement renflée à son extrémité et translucide. Les puits où l’inhibition est partielle ne produiront pas de « larme ».

b) Typage des isolats de SIV

• Test d’inhibition de l’hémagglutination

I) Diluer les antigènes HA de référence (H1, H3, etc.) à une concentration de 8 unités HA (HAU) pour 50 µl (4 HAU/25 µl) dans du PBS 0,01 M, pH 7 ;

II) Standardiser les virus influenza A inconnus afin qu’ils contiennent 8 HAU dans 50 µl ;

III) Effectuer un nouveau titrage (test d’HA) pour tous les isolats inconnus et les antigènes de sous-type H afin de vérifier que le nombre d’unités HAU est correct. Le titrage de contrôle est réalisé comme décrit dans le protocole du test d’HA, à l’exception près que 6 puits de dilutions sont utilisés au lieu de 11 ;

IV) Traiter le sérum au RDE : ajouter 50 µl de sérum à 200 µl de RDE (Receptor-Destroying Enzyme ; dilué au 1/10 dans une solution saline de calcium, ce qui équivaut à 100 unités par ml). Incuber une nuit (12 à 18 h) dans un bain-marie à 37°C. Ajouter 150 µl d’une solution de citrate de sodium à 2,5 % et inactiver le sérum à la chaleur à 56°C pendant 30 min. Mélanger 200 µl d’échantillon traité et 25 µl de PBS afin de réaliser une dilution au 1/10 du sérum.
Remarque : le traitement RDE est recommandé car il éliminera l’hémagglutination non spécifique et améliorera l’identification des isolats H1N2 et
H3N2 ;

V) Eliminer les agglutinines sériques naturelles en traitant 1 ml de sérum dilué par 0,1 ml d’érythrocytes concentrés et lavés. Incuber pendant 30 min à température ambiante en mélangeant de temps en temps afin de maintenir les érythrocytes en suspension. Centrifuger les sérums traités à 800 gpendant 10 min, puis les réserver ;

VI) Distribuer 25 µl d’antigène standardisé (isolat inconnu ou antigène témoin positif) dans 3 puits d’une plaque de microtitrage à 96 puits à fond en V ou en U. Ajouter 50 µl de PBS dans plusieurs puits qui serviront de témoin cellulaire érythrocyte. Remarque : 25 µl de PBS peuvent être utilisés à la place des 25 µl d’antigène standardisé ;

VII) Ajouter 25 µl d’antisérum standardisé approprié dans le premier puits du sous-type H devant être testé.
Diluer l’antisérum en série dans les puits antigène, dans un volume de 25 µl, à l’aide d’une pipette réglée pour délivrer 25 µl. Répéter cette procédure pour chacun des sous-types H devant être testé.

Remarque : si 25 µl de PBS sont utilisés à la place des 25 µl d’antigène standardisé à l’étape VI), ajouter 25 µl d’antigène standardisé dans chaque puits contenant l’antisérum standardisé ;

VIII) Couvrir la (les) plaque(s) et incuber à température ambiante pendant 20 à 60 min ;

IX) Ajouter 50 µl d’une suspension d’érythrocytes à 0,5 % dans chaque puits et agiter la (les) plaque(s) pour bien mélanger. Bien maintenir les érythrocytes en suspension pendant la phase de répartition ;

X) Couvrir les plaques avec un film adhésif et incuber à température ambiante jusqu’à ce qu’un culot distinct se soit formé dans les puits témoins positif (généralement 30 à 60 min). Pour évaluer l’hémagglutination, observer les plaques après environ 20 min d’incubation étant donné que certains isolats pourraient commencer à éluer (se détacher des érythrocytes) au bout de 30 min ;

XI) Lire les résultats du test comme décrit plus haut pour le test d’HA. Un échantillon est considéré positif pour un sous-type H donné si l’hémagglutination est inhibée. Le test est considéré valide si l’antigène de référence positif et son antisérum homologue fournissent le titre IHA attendu et que le titrage de contrôle de chaque antigène (inconnu et témoin positif) est de 8 HAU. Si ces conditions ne sont pas respectées, le test doit être répété ;

XII) Si les érythrocytes des puits témoin cellulaire ne se déposent pas en un culot bien formé, tester les points suivants comme causes possibles : formulation incorrecte du PBS, évaporation excessive à partir des plaques, érythrocytes trop vieux, ou concentration incorrecte d’érythrocytes.

• Test d’inhibition de la neuraminidase

L’identification du sous-type basée sur le test d’inhibition de la neuraminidase (IN) n’est pas du ressort de nombreux laboratoires. Les laboratoires de référence doivent être consultés pour le typage N des isolats.

c) Epreuve d’immunofluorescence

I) Cette technique peut être utilisée sur des coupes de tissu ou sur des monocouches de cellules infectées étalées sur lames ou lamelles. Des témoins positifs et négatifs doivent être inclus dans tous les protocoles de marquage ;

II) Les cellules inoculées sont incubées pendant une durée de temps appropriée pour que 10 à 25 % d’entre-elles soient infectées par le virus. Rincer la lamelle ou la lame une fois dans du PBS, la placer dans 100 % d’acétone pendant 5 à 10 min et sécher à l’air. L’acétone doit être utilisée sous hotte ventilée ;

III) Préparer les coupes de tissu congelé sur des lames de verre. Fixer les lames de verre à l’acétone pendant 5 à 10 min et sécher à l’air ;

IV) Déposer le conjugué (anticorps anti-virus influenza porcin couplé à la fluorescéine) et incuber en chambre humide à 37°C pendant 30 min ;

V) Laver dans du PBS, pH 7,2, faire tremper pendant 5 à 10 min dans du PBS frais, rincer à l’eau distillée et sécher à l’air ;

VI) Déposer des lamelles sur les lames de verre, face cellule en bas, avec du milieu de montage. Enlever le joint d’étanchéité en caoutchouc des chambres de culture sur lame et ajouter du milieu de montage puis une lamelle de verre. Les coupes de tissu sur lame sont également recouvertes de milieu de montage et de lamelle ;

VII) Observer les lames marquées dans une chambre noire au microscope à épifluorescence. Les cellules infectées par du SIV sont identifiées par la présence d’une fluorescence brillante vert pomme. Il est recommandé que la personne qui examine les lames soit entraînée à la lecture de lames marquées en fluorescence, car celles-ci peuvent être difficiles à interpréter.

d) Immunohistochimie (19)

I) Découper en sections de 4 µm d’épaisseur des échantillons de poumon préalablement fixés au formol et inclus dans de la paraffine, et les placer sur des lames recouvertes de poly-L-lysine. Des tissus témoins positif et négatif doivent être inclus dans tous les tests ;

II) Chauffer les lames à 60°C pendant 15 min, déparaffiner et réhydrater par immersion dans des concentrations décroissantes d’éthanol puis dans de l’eau distillée ;

III) Traiter les échantillons au peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 min et rincer 2 fois à l’eau distillée ;

IV) Digérer les échantillons avec 0,05 % de protéase pendant 2 min et rincer 2 fois 2 min à température ambiante dans du tampon PBS contenant 0,1 M de Tris, pH 7,2 ;

V) Déposer l’anticorps monoclonal de souris anti-SIV (dirigé contre la nucléoprotéine virale) sur chaque lame et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4°C pendant la nuit. Rincer les lames avec du tampon PBS/Tris ;

VI) Déposer l’anticorps secondaire (anticorps de chèvre anti-souris biotinylé) pendant 10 min à température ambiante. Rincer avec du tampon PBS/Tris ;

VII) Déposer l’anticorps tertiaire (streptavidine conjuguée à la peroxydase) pendant 10 min à température ambiante. Rincer avec du tampon PBS/Tris ;

VIII) Ajouter une solution de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine pendant 5 min à température ambiante. Rincer 2 fois à l’eau distillée ;

IX) Contre-colorer les lames dans de l’hématoxyline de Gill pendant 10 à 30s, laver à l’eau pendant 2 min, déshydrater, clarifier et ajouter les lamelles ;

X) Les tissus infectés par le SIV sont identifiés par la présence de marquage brun dans l’épithélium bronchique et dans les pneumocytes.

e) ELISA de capture d’antigène

Des épreuves immuno-enzymatiques (ELISA) de capture d’antigènes de type A sont disponibles dans le commerce pour la détection des virus influenza humains. Ce genre d’essais a été utilisé pour la détection du SIV dans le tissu pulmonaire et les écouvillons nasaux (10, 17). Les tests sont généralement disponibles auprès de compagnies pharmaceutiques.

f) Réaction de polymérisation en chaîne par polymérase (PCR)

Des épreuves de réaction de polymérisation en chaîne par polymérase (PCR) ont été développées pour le diagnostic de la grippe porcine (6). Des informations approfondies sur la validation de ces épreuves ne sont pas disponibles à l’heure actuelle.

2. Épreuves sérologiques
La principale épreuve sérologique pour la détection des anticorps anti-SIV est l’IHA et elle est spécifique du sous-type. Elle doit être conduite sur des paires de sérums collectés à 10-21 jours d’intervalle. Une augmentation du titre de 4 fois ou plus, entre le premier et le second prélèvement, suggère une infection SIV récente. Les autres épreuves sérologiques qui ont été décrites, mais qui ne sont pas couramment utilisées, sont la neutralisation virale, le test d’immunodiffusion en gélose et l’épreuve d’immunofluorescence indirecte. La technologie ELISA pour la détection des anticorps anti-SIV a été décrite dans la littérature et au moins une trousse de diagnostic commerciale a été mise sur le marché. La validation de ce(s) trousse(s) ELISA est (sont) en cours.

• Test d’inhibition de l’hémagglutination

I) Diluer les antigènes HA de référence (H1, H3, etc.) à une concentration de 4 à 8 HAU/25 µl dans du PBS 0,01 M, pH 7,2 ;

II) Test H1N1 : Inactiver les sérums à la chaleur pendant 30 min à 56°C. Diluer au 1/10 dans du PBS. A 1 ml de sérum inactivé à la chaleur et dilué, ajouter 0,1 ml d’érythrocytes de poulet concentrés et lavés.
Mélanger. Incuber à température ambiante pendant 30 min en agitant régulièrement toutes les 10 à 15 min. Centrifuger à 800 g pendant 10 min à 4°C. Remarque : les sérums peuvent être traités au RDE et aux érythrocytes de poulet comme décrit à l’étape III) ci-dessous au lieu d’être inactivés à la chaleur et traités aux érythrocytes de poulet ;

III) Test H1N2 et H3N2 : Ajouter 50 µl de sérum à 200 µl de RDE dilué au 1/10 dans une solution saline de calcium, ce qui équivaut à 100 unités par ml. Incuber toute la nuit (12 à 18 h) dans un bain-marie à 37°C. Ajouter 150 µl de solution de citrate de sodium à 2,5 % et inactiver à la chaleur à 56°C pendant 30 min. Mélanger 200 µl d’échantillon traité et 25 µl de PBS. Ajouter 50 µl d’une solution d’érythrocytes de poulet ou de dindon à 50 %, jusqu’à diluer le sérum au 1/10. Agiter et incuber pendant 30 min à température ambiante ou une nuit à 4°C. Centrifuger à 800 gpendant 10 min à 4°C. Remarque : les érythrocytes de poulet sont recommandés pour tous les isolats européens ;

IV) Distribuer 50 µl de sérum traité dans 2 puits d’une plaque de 96 puits à fond en V ou en U. Distribuer 25 µl de sérum traité dans 2 puits qui serviront de sérum témoin. Les sérums témoin positif et négatif sont traités de la même manière que les sérums inconnus ;

V) Distribuer 25 µl de PBS dans les puits témoin pour le sérum et dans tous les puits vides, à l’exception de 2 puits identifiés comme puits témoin cellulaire. Ajouter 50 µl de PBS dans ces puits témoins cellulaires ;

VI) Diluer le sérum en série dans la plaque, de 2 en 2, sous 25 µl de volume, puis ajouter 25 µl d’antigène approprié dans tous les puits du test, à l’exception des puits témoins pour le sérum et les cellules ;

VII) Recouvrir les plaques et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 min ;

VIII) Ajouter 50 µl de suspension d’érythrocytes à 0,5 % (poulet pour H1N1 et dindon pour H3N2) dans chaque puits, agiter et incuber à température ambiante pendant 20 à 30 min jusqu’à ce qu’un culot distinct se forme au fond des puits témoin cellulaire. Bien maintenir les érythrocytes en suspension pendant la phase de distribution ;

IX) Préalablement et simultanément à l’IHA, réaliser un test HA sur les antigènes utilisés en IHA afin de vérifier que leurs concentrations sont appropriées ;

X) Pour que le test soit valide, il ne doit pas y avoir d’hémagglutination dans les puits témoins pour le sérum, pas d’inhibition de l’hémagglutination avec le sérum négatif, le sérum positif doit fournir le titre IHA attendu et le titrage HA de contrôle doit indiquer 4 à 8 HAU pour 25 µl.

b) Epreuve immuno-enzymatique (ELISA) (9)

La technologie ELISA pour la détection des anticorps SIV a été décrite dans la littérature. Au moins un test ELISA est disponible sous forme de trousse de diagnostic commercialisée.

Références 

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Conakry, le 2 mai 2009
Dr Kaba KOUROUMA